Mathias Uhlén 博士

    抗體是生物學(xué)研究中的zui常用的一種工具，廣泛應(yīng)用于與免疫檢測相關(guān)的研究技術(shù)中，包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、免疫印跡、免疫沉淀和免疫組化等。同時，抗體也是臨床監(jiān)控的重要工具，可用于相關(guān)的診斷和治療。

    然而，近年來，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)，抗體相關(guān)研究一直存在嚴(yán)重的“重現(xiàn)危機”。研究使用的抗體在質(zhì)量和性能一致性方面存在巨大的差異，對生物醫(yī)學(xué)研究的可重復(fù)性造成了顯著的不良影響。

    想要改善這一困境，加強抗體驗證是zui有效的途徑之一。然而，遺憾的是，很長一段時間內(nèi)，業(yè)界都沒能建立全面、統(tǒng)一、規(guī)范的驗證策略和科學(xué)框架。許多研究者呼吁出臺相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)，以確?？贵w在特異性和質(zhì)量上的一致性。

    9月5日，抗體驗證工作組（International Working Group for Antibody Validation，IWGAV）在Nature Methods上發(fā)表了首篇關(guān)于驗證抗體特異性策略的提議，確定了五大“支柱策略”（具體如下），用以指導(dǎo)特定應(yīng)用中的抗體驗證。

1.基因策略：利用CRISPR/Cas或RNAi等技術(shù)，將對照細胞或組織中的目標(biāo)基因敲除或敲低，并檢測這些對照細胞或組織中的相關(guān)信號。

2.正交策略：使用非抗體依賴方法對大量樣品進行定量，并檢測基于抗體和非抗體定量間的相關(guān)性。

3.獨立抗體策略：使用2種或多種可識別目標(biāo)蛋白表面不同抗原決定簇的獨立抗體，并通過對比或定量分析確定特異性。

4.標(biāo)簽蛋白的表達：為內(nèi)源性目標(biāo)基因添加親和標(biāo)簽或熒光蛋白標(biāo)簽，利用抗體檢測方法可對來自標(biāo)簽蛋白的信號進行校正。

5.免疫捕獲及質(zhì)譜分析（MS）：免疫沉淀（IP）技術(shù)可通過使用與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合的抗體分離出目標(biāo)蛋白，其與MS分析結(jié)合（IP-MS）可識別與純化抗體直接發(fā)生相互作用的目標(biāo)蛋白以及可能與目標(biāo)蛋白形成復(fù)合物的蛋白。

    對抗體的驗證可以確?？贵w特異性識別目標(biāo)抗原、性能不受時間影響，并且zui終所有使用者都可以根據(jù)正確的實驗方案得到相同的結(jié)果。IWGAV提出的這一驗證策略初步建議向著驗證抗體特異性和實現(xiàn)研究的可重復(fù)性邁出了堅實的一步。

    那么，這些驗證策略究竟是如何確定的？根據(jù)這一提議，科研人員和抗體生產(chǎn)商們應(yīng)該如何做？是否需要第三方參與抗體特異性的驗證以確保公平性？驗證工作帶來的額外費用是否會影響提議的推廣？近日，IWGAV主席、瑞典斯德哥爾摩*理工學(xué)院微生物學(xué)教授Mathias Uhlén博士接受了生物探索的專訪，并就這些問題分享了他的看法。

短短1年內(nèi)，IWGAV發(fā)表首篇“驗證策略”提議

    IWGAV是*家為抗體生產(chǎn)商和使用者制定抗體驗證策略的組織，旨在推進行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的建立，幫助解決抗體特異性和可重復(fù)性方面的挑戰(zhàn)。據(jù)了解，賽默飛世爾科技（以下簡稱賽默飛）為IWGAV的成立提供了資金支持。短短一年內(nèi)，IWGAV發(fā)表了首篇“驗證策略”提議。

    除Uhlén博士外，上述驗證策略是由來自亞洲、歐洲和北美的多位生物醫(yī)藥研究領(lǐng)域研究者共同參與完成。Uhlén博士認(rèn)為，驗證抗體特異性是目前確?？贵w持續(xù)可重復(fù)性zui重要的步驟。他說：“這是需要處理的首要問題，并且我們可以看到，后續(xù)操作需要依附這一步驟。”

    IWGAV建議至少需要使用這幾種支柱策略中的一個，以表明某一抗體已被充分驗證，可用于某一應(yīng)用中。此外，IWGAV還表示，多種策略的結(jié)合使用能夠為抗體特異性提供更加可靠的證據(jù)。

    Uhlén博士強調(diào)，以往，業(yè)內(nèi)缺乏檢測抗體結(jié)合特異性和有效性的*操作規(guī)范，IWGAV創(chuàng)建這些抗體驗證策略的主要目的就是用于解決檢測抗體特異性的難題。在這一年中，IWGAV審視了抗體的用途，并在制訂抗體驗證策略時將其考慮進去，zui終制訂出了在不同應(yīng)用中驗證抗體特異性的支柱策略。

    回顧在這一過程中遇到的挑戰(zhàn)，Uhlén博士說：“在確定支柱策略時，需要減少我們建議的驗證方法的數(shù)量。我們查看了其它特異性驗證方法（例如，親和力檢測、DNA測序、同型檢測等），zui終發(fā)現(xiàn)，這些方法終究無法直接反映抗體的特異性或交叉反應(yīng)性。因此，我們將它們從驗證抗體特異性的首要方法中排除了出去。”

2

重視抗體特異性驗證，推動行業(yè)健康發(fā)展

    抗體特異性驗證對研究非常重要，并且對研究共同體中的每一方（包括生產(chǎn)商、使用者以及投資者）都有著重大的影響。缺乏全面系統(tǒng)的、用于確定抗體有效性的*規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)方法，對于生物醫(yī)藥研究具有嚴(yán)重的潛在危害。未經(jīng)充分驗證的抗體有可能帶來不可靠的研究結(jié)果，甚至產(chǎn)生錯誤的結(jié)論，耽誤重要研究進展的獲得；此外，還將導(dǎo)致時間、精力、材料、金錢等資源的浪費。

    Uhlén博士介紹稱，進行抗體驗證的關(guān)鍵在于，確?？贵w能特異性識別其預(yù)期靶標(biāo)，并持續(xù)保持相似的性能，從而讓所有按照既定實驗方案操作的使用者zui終都能獲得相同的結(jié)果。IWGAV提出的這些驗證策略是抗體特異性和重復(fù)性驗證*的起始步驟。

    他說：“在抗體供應(yīng)商尚未對所有抗體進行驗證，用戶沒有現(xiàn)成的驗證數(shù)據(jù)可用時，我建議研究人員要堅持使用更多的方法，自己進行有效性檢測和靶標(biāo)鑒定。他們可以在論文中發(fā)布盡可能多的信息，例如，驗證抗體特異性的方法、產(chǎn)品貨號、批號，可能還要加上資源標(biāo)識（Resource Identifiers，RRIDs），以確保研究中所使用的試劑（如抗體）可以被無誤地確認(rèn)來源。”

   “對于生產(chǎn)商，我建議他們通過各種現(xiàn)有的技術(shù)（如CRISPR、免疫捕獲加質(zhì)譜分析、標(biāo)簽蛋白表達、siRNA、獨立抗體驗證和正交策略）驗證抗體與靶標(biāo)的結(jié)合，并對每一新批次的抗體進行重復(fù)驗證，以確認(rèn)檢測到的數(shù)據(jù)是否與現(xiàn)有數(shù)據(jù)一致，并具有相關(guān)性。”

多方共同參與，制定更完善的抗體“驗證策略”

    作為IWGAV的資金支持方，在該驗證策略發(fā)布不久后，賽默飛承諾會根據(jù)新的抗體驗證策略驗證抗體的特異性。這也是在賽默飛所有抗體驗證的方法之外，對抗體特異性驗證的完善。據(jù)悉，公司還將在其上用圖標(biāo)或標(biāo)志對符合新標(biāo)準(zhǔn)的抗體加以標(biāo)識，以表明其通過了特異性測試。

    談及賽默飛對抗體驗證工作的大力支持。Uhlén博士說：“很高興看賽默飛在其已有抗體驗證方法的基礎(chǔ)上，將這些策略指南運用于其更多的產(chǎn)品線。IWGAV綜合驗證策略的廣泛應(yīng)用需要研究機構(gòu)、出版方、資助機構(gòu)和抗體生產(chǎn)商的持續(xù)參與。所有利益相關(guān)方在此提案的采納和實施中均將發(fā)揮重要作用。”

    值得一提的是，對于使用者和生產(chǎn)商而言，抗體特異性驗證必然會帶來額外的費用。這是否會影響這一驗證策略的推廣和落實呢？Uhlén博士的答案是否定的。他解釋道：“抗體全面驗證策略缺失zui終導(dǎo)致的時間、精力、材料和金錢的浪費，比使用支柱策略帶來的相關(guān)花費要更高。在范圍內(nèi)，每年由于使用缺乏驗證的抗體而造成的研究經(jīng)費損失大約為8億美元。”

    此外，對于是否需要第三方機構(gòu)的參與來保證抗體驗證結(jié)果的真實性，他說：“第三方機構(gòu)參與評估會有幫助，但這可能并不是zui切實際的期望。如果生產(chǎn)商和研究人員都采用合適的支柱策略去驗證抗體的有效性，第三方機構(gòu)就沒有必要介入了。 ”

結(jié)語

    采訪的zui后，Uhlén博士告訴生物探索記者，除9月份刊發(fā)在Nature Methods上外，他還通過部分其它重要媒體渠道對生物醫(yī)藥研究機構(gòu)詳細闡述過這些驗證策略，也在抗體生產(chǎn)商和用戶會議上談?wù)撨^這一初步提議。“此外，zui近我參加了在美國舉辦的生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（GBSI）會議及在中國臺灣舉辦的第15屆人類蛋白質(zhì)組組織（HUPO）大會，會上，我也向業(yè)內(nèi)人士介紹了這些支柱策略。”他說。

    IWGAV表示，這份建議將作為建立通用抗體驗證標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)，鼓勵所有利益相關(guān)方通過各種渠道給出反饋。Uhlén博士zui后說道：“IWGAV希望通過努力整合業(yè)內(nèi)成員的反饋意見，重新審視這些驗證策略，開發(fā)出更完善的指導(dǎo)原則。”

關(guān)于Mathias Uhlén博士

    Uhlén博士于1984年在瑞典斯德哥爾摩的*工學(xué)院獲得博士學(xué)位，1988年成為瑞典*工學(xué)院的微生物學(xué)教授。他的研究主要集中在蛋白質(zhì)科學(xué)、抗體工程和醫(yī)學(xué)，具體內(nèi)容涉及人類和微生物生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究，包括在癌癥、傳染性疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病和神經(jīng)生物學(xué)中的臨床應(yīng)用。這些研究已經(jīng)產(chǎn)出了超過550份出版物，目前的H指數(shù)（谷歌學(xué)術(shù)）為98。

    Uhlen博士不僅是美國國家工程院、瑞典*科學(xué)院、瑞典工程科學(xué)院和歐洲分子生物學(xué)組織的成員，還是歐洲生物技術(shù)聯(lián)合會的董事長，并同時擔(dān)任UniProt科學(xué)咨詢委員會和IWGAV的主席。自2003年以來，Uhlén博士領(lǐng)導(dǎo)一個小組，致力于系統(tǒng)化地描繪人類抗體的蛋白質(zhì)組，創(chuàng)建了開放性的Human Protein Atlas（www.proteinatlas。。ｏｒｇ）。