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滬鼎分享實驗:免疫組化,八步驟三特點

日期:2014/4/1瀏覽:626次

步驟

1、石蠟切片置于67℃烘箱中,烘片2小時,脫蠟至水,用pH7.4的PBS沖洗三次,每次3分鐘(3×3’)。
2、取一定量pH=6.0檸檬酸鹽緩沖液,加入微波盒中,微波加熱至沸騰,將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上,放入已沸騰的緩沖液中,中檔微波處理10分鐘,取出微波盒流水自然泠卻,從緩沖液中取出玻片,先用蒸餾水沖洗兩次,之后用PBS沖洗2×3’。
3、每張切片加1滴3%H2O2,室溫下孵育10分鐘,以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗3×3’。
4、除去PBS液,每張切片加1滴相應(yīng)的*抗體(相應(yīng)稀釋倍數(shù)),室溫下孵育2小時。
5、PBS沖洗3×5’。除去PBS液,每張切片加1滴聚合物增強劑,室溫下孵育20分鐘。PBS沖洗3×3’。
6、除去PBS液,每張切片加1滴酶標(biāo)抗鼠/兔聚合物,室溫下孵育30分鐘。PBS沖洗3×5’。
7、除去PBS液,每張切片加1滴新鮮配制的DAB液(二氨基聯(lián)苯胺),顯微鏡下觀察5分鐘。
8、蘇木素復(fù)染,0.1%HCl分化,自來水沖洗,藍化,切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固,晾干后觀察。

特點
1、在切片加上一抗后,第二抗體標(biāo)記多聚螯合物酶(HRP)的復(fù)合物與一抗結(jié)合,在多聚螯合物上有大量的HRP分子,使抗原信號有顯著的放大,其敏感性較SABC、SP法高。
2、由于多聚物在體內(nèi)不存在,又不使用生物素,從而避免了由于生物素引起的非特異性背景染色,背景比SABC、SP法清晰。
3、辣根過氧化物酶與二抗結(jié)合在多聚物上,替代傳統(tǒng)方法的 二抗、三抗,減少了實驗步驟,且試劑孵育時間短,只需15分鐘,使得免疫組化方法更簡單,實驗時間比SABC、SP法大為縮短。

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