干擾素的實驗步驟及其注意事項

日期：2013-03-27瀏覽：3160次

干擾素（IFN）是一種廣譜抗病毒劑，并不直接殺傷或抑制病毒，而主要是通過細胞表面受體作用使細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白，從而抑制乙肝病毒的復制；同時還可增強自然殺傷細胞（NK細胞）、巨噬細胞和T淋巴細胞的活力，從而起到免疫調節(jié)作用，并增強抗病毒能力。干擾素是一組具有多種功能的活性蛋白質（主要是糖蛋白），是一種由單核細胞和淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子。它們在同種細胞上具有廣譜的抗病毒、影響細胞生長，以及分化、調節(jié)免疫功能等多種生物活性。

實驗步驟

1. 制備誘生劑：采用NDVF系弱毒株，以雞胚尿囊液形式保存于-20℃，

其血凝滴度穩(wěn)定在1:640～1:1 280之間。大量繁殖時，用0.5%水解乳蛋白稀釋100～1 000倍，接種于9日齡雞胚尿囊腔，置37℃培養(yǎng)72h后，收獲尿囊液，效價測定應大于1:640，無菌檢查應合格。

2. 制備誘生細胞：無菌采取人外周血（多用人臍帶血，或血庫貯藏血），置于含肝素的無菌瓶內，于4℃保存不超過24h，誘生細胞（白細胞）不單獨提取，以全血代替。

3. 制備粗制干擾素：

1）加誘生劑，按1ml抗凝全血加0.2ml誘生劑（即NDVF系尿囊液，其血凝滴度不低于1:640）；

2）加溫吸附，將加有誘生劑的抗凝全血置37℃水浴中1h，每隔15min晃動一次，使NDVF吸附于白細胞上。然后以1000r/min離心20min，棄上清，留沉淀物；

3）加營養(yǎng)液孵育誘生，按抗凝全血的1～2倍量加Eagle營養(yǎng)液于上述沉淀物中，混勻，置35～36℃溫箱內旋轉培養(yǎng)18～20h；

4）離心及酸處理，將上述培養(yǎng)物以2000r/min離心30min，取上清，以6mol/L鹽酸將其pH值調至2.0，置4℃冰箱5天滅活NDV；

5）中性化，經(jīng)5天酸化后，再用6mol/L氫氧化鈉將pH值調至7.2～7.4，即為粗制干擾素。

4. 制備精品干擾素：

1） KCNS沉淀，取上述粗制干擾素，加KCNS并用2mol/L HCl調pH值為3.5，然后以2 000r/min離心30min取沉淀；

2）酒精提取，將沉淀溶于95%酒精（預冷至-20℃），用2mol/L NaOH調pH值為4.2，以2 000r/min離心30min取上清；用2mol/L HCl調pH值至3.5，離心后取上清，再將pH值調至5.6，離心后取上清，zui后將pH值調至7.1，離心后取沉淀；

3）過碘酸鈉沉淀，將沉淀溶于PBS中，加過碘酸鈉，并調pH值為4.5，用50%乙醇10倍稀釋，離心后取上清，將上清液對0.3mol/L （NH4 ）2 CO3 （pH值7.6）在4℃下透析過夜。

4） sephacryl S200柱層析：將sephacryl S200按要求處理后裝柱（4～5×100cm柱），用PBS平衡后，加樣（即上述上清液），用洗液洗脫。洗脫期間用核酸蛋白儀連續(xù)檢測，收集相應峰即為精制干擾素。取樣進行效價測定，按結果進行稀釋，分裝并凍干。

5. 檢定

1）效價測定

a. 制備攻擊病毒：將水泡性口炎病毒（VSV）在雞胚成纖維母細胞上傳代后，

再在豬細胞（IBRS）上傳3～5代，使其對IBRS有良好致病效應，其TCID50應穩(wěn)定（一般在10-6 ～10-7 之間）。

b. 準備測定細胞：生長良好的幼齡IBRS單層細胞。

c. 測定：取上述單層細胞分為若干組，每組加不同稀釋度的干擾素，置37℃孵育20～24h，然后每管均用100個TCID50的VSV攻擊，置37℃ 48～72h孵育后，觀察結果。同時設細胞對照組和病毒對照組。病毒對照組CPE＞75%，正常細胞對照組CPE=0，即認為該測定系統(tǒng)有效。干擾素判定標準是以能保護半數(shù)細胞免受攻擊病毒損害的干擾素zui高稀釋度的倒數(shù)作為干擾素的單位。

2）酸堿度測定

取本品10支，加水溶解，精密測量pH值應為6.0～7.5。

3）水分測定

按磺硫溶液法測定，不得超過3%。

4）安全試驗

取本品加水溶解，小鼠尾靜脈注射，48h內不得有死亡。

5）熱原檢查

取本品1支，加水溶解，依法檢查，應符合規(guī)定。

6）菌檢

取本品3支，無菌水溶解，分別接種到檢查需氧菌、厭氧菌及霉菌用培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)1周，應無菌生長。

7）超敏反應

取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品適量，連續(xù)3次，于20天后再于耳靜泳注入本品適量，應無過敏反應現(xiàn)象發(fā)生。